Регуляция пола у сельскохозяйственных животных представляет значительный практический интерес, поскольку способствует ускорению генетического прогресса в селекционно-племенной работе. Ранее изучалась возможность разделения сперматозоидов, содержащих Х- или Y-хромосому следующими способами: осаждение, центрифугирование в градиенте, электрофорез, обработка специфическими антителами и т.д. (1-3). Однако на практике не было получено убедительных доказательств эффективности этих приемов.

В последние годы во многих странах мира для разделения спермы по полу используют метод проточной цитометрии, основанный на различном содержании ДНК в сперматозоидах (4-6). В 1979 году было установлено, что Х-хромосома млекопитающих содержит большее количество ДНК по сравнению с Y-хромосомой (7). Так, у быков это различие составляет 3,8, у хряков — 3,6, у баранов — 4,2, у жеребцов — 3,7 % (4, 8). При разделении сперматозоидов было предложено использовать специальный краситель для ДНК и аналитическую проточно-цитометрическую систему, которую дополнили приспособлением для направленной ориентации клеток в потоке, что способствует более четкому выявлению различий в их светоизлучении (9).

На основании результатов исследований, проведенных американскими учеными, была усовершенствована обычная аналитическая проточно-цитометрическая система и разработана Белтсвилская технология разделения спермы, которая состоит из нескольких операций (10, 11). В состав разбавленной спермы добавляют флуоресцентный витальный краситель Hoechst 33342 и инкубируют ее при 35 °С в течение 1 ч для лучшего проникновения красителя через мембранные структуры половых клеток. Затем сперма под давлением поступает в высокоскоростной проточный цитометр, где создаются условия ориентации головки сперматозоидов при пересечении лазерного луча. Лазерное излучение инициирует флуоресценцию красителя, которая улавливается мощным световым детектором и анализируется компьютером. После идентификации сперматозоидов, содержащих Х или Y-хромосому, специальный вибратор образует в растворе микрокапельки, куда попадают половые клетки. Каждая микрокапелька содержит один сперматозоид и заряжается положительно или отрицательно в зависимости от величины светоизлучения, обусловленной содержанием в половой клетке Х- или Y-хромосомы. Капельки с поврежденными или не идентифицированными сперматозоидами не заряжаются. В современных установках образуется 70-80 тыс. микрокапелек в секунду (12). После этого сперматозоиды проходят через электростатическое поле и разделяются на положительно, отрицательно или нейтрально заряженные частицы, которые поступают в разные емкости. Затем сперматозоиды центрифугируют для увеличения их концентрации и разбавляют специальной средой (13-15).

В первое время после разработки описанной технологии использовали стандартную скоростную систему с рабочим давлением в пределах 0,84 кг/см2. При этом скорость разделения клеток составляла 350 тыс сперматозоидов в час (10). Позднее, когда технология была усовершенствована, в том числе за счет повышения давления в системе до 4,22 кг/см2, стало возможным сортировать до 11 млн сперматозоидов в час и получать образцы, содержащие 90 % клеток с Х- или Y-хромосомой (8).

Были проведены углубленные исследования в области улучшения ориентации головки сперматозоидов относительно лазерного луча и оптического детектора (5, 14, 16). Вследствие плоской формы головки лишь 30 % клеток имеют правильную пространственную ориентацию при прохождении через лазерный луч, причем только половина из них содержит Х- или Y-половую хромосому. Из общего объема эякулята удается получить не более 15 % сперматозоидов с определенной половой хромосомой, что обусловливает высокую стоимость разделенного по полу семени. В настоящее время разделенная сперма быков может быть экономически выгодной производителю только если в дозе содержится пониженное число сперматозоидов (~ 2 млн подвижных клеток по сравнению с 10-15 млн сперматозоидов, применяемых при обычном осеменении крупного рогатого скота криоконсервированной спермой).

Во время разделения с помощью высокоскоростной проточной цитометрии сперматозоиды подвергаются действию таких неблагоприятных факторов как окрашивание, высокая степень разбавления семени, воздействие лазерного излучения и давления, электромагнитное влияние, центрифугирование (17-19), поэтому важна разработка условий для сохранения биологической полноценности половых клеток. В частности, для предохранения их от агглютинации в состав буферного раствора вводят 0,1 % бычьего сывороточного альбумина, а после разделения сперматозоиды попадают в TEST-желточный буфер (20). Показано, что лучшая подвижность сперматозоидов после оттаивания сохраняется в случае центрифугирования половых клеток сразу после разделительного процесса и добавления глицерина в состав охлажденного до 4 °С семени незадолго до замораживания (21). Для проверки чистоты разделения образцов спермы на Х- и Y- фракции применяют полимеразную цепную реакцию (22), а также метод флуоресцентной гибридизации (23).

В 1988 году установлено, что разделенные с помощью проточной цитометрии сперматозоиды способны к образованию пронуклеуса при введении в ооциты хомячков (24). В том же году английскими исследователями были проведены первые опыты по использованию разделенной спермы для искусственного осеменения телок и крольчих (25). Две группы телок осеменяли с помощью цервикального введения фракции сперматозоидов с Х- или Y-хромосомой. В дозе содержалось 5 млн клеток. Оплодотворяемость животных оказалась очень низкой, и телки в основном абортировали между 4-м и 5-м мес беременности. Изучение половых органов у абортированных плодов показало, что в случае осеменения Х-фракцией 8 из 11 плодов были самками, при использовании Y-фракции 12 из 20 плодов — самцами. Низкие результаты оплодотворяемости были получены и у крольчих, однако в этом случае удалось получить живых крольчат, которые нормально развивались и в дальнейшем принесли здоровое потомство.

В опытах американских ученых по осеменению крольчих сперму самкам вводили внутриматочно. В группе, где использовали фракцию сперматозоидов с Х-хромосомой, получили 94 % самок, с Y-хромосомой — 81 % самцов (10). Внутритрубное введение свиньям разделенного по полу семени хряков позволило получить в потомстве 68 % самцов при оплодотворении спермой с Y-хромосомой и 74 % самок при использовании Х-фракции (20).

Позднее были проведены успешные эксперименты по оплодотворению яйцеклеток крупного рогатого скота разделенными сперматозоидами in vitro (26). С помощью проточной цитометрии получали фракции спермы, содержащие до 79 % половых клеток с Х-хромосомой и до 70 % — с Y-хромосомой. Телкам пересаживали эмбрионы предполагаемого пола, в результате чего в первой группе родилось 3 телочки, во второй — 3 бычка. В последующих опытах удалось получить до 90 % телят мужского пола (27).

Также был проведен ряд экспериментов по изучению эффективности пересадки коровам эмбрионов, полученных in vitro с помощью разделенного семени (28). Приживляемость эмбрионов у коров со спонтанным эструсом составила 16,3, у коров с синхронизированным эструсом — 20,0, у телок — 34,2 %. Из 40 родившихся телят 37 были телочками.

В более поздних исследованиях изучали эффективность пересадок коровам заморожено-оттаянных эмбрионов, полученных in vitro с использованием фракции Х-сперматозоидов (29). Приживляемость таких эмбрионов в опытной группе составила 40,9 %, в контрольной, где использовались обычные эмбрионы, — 41,9 %. Всего родилось 458 телят, из которых 96,8 % были самками.

В связи с тем, что скорость разделения сперматозоидов при проточной цитометрии не позволяет получать достаточно семени для обычного искусственного оплодотворения крупного рогатого скота, была изучена возможность введения половых клеток непосредственно в рога матки (30, 31). Не разделенную сперму, содержащую 100-500 тыс. сперматозоидов, вводили в рог матки телок с помощью инструментов для эмбриопересадки. В некоторых группах результаты оплодотворяемости были довольно высокими. Затем для осеменения телок использовали разделенную фракцию не замороженной спермы, содержащей в дозе 100-200 тыс. сперматозоидов. Из 17 полученных телят 14 соответствовали предполагаемому полу (31). В другом опыте 35 телкам в рога матки вводили по 300 тыс. не замороженных разделенных сперматозоидов, содержащих преимущественно Х-хромосому, а контрольных животных осеменяли такой же дозой не разделенной спермы. Оплодотворяемость в опытной группе составила 42 %, в контроле — 54 %. В опытной группе было получено 80 % телочек (32). В экспериментах по осеменению пониженной дозой заморожено-оттаянных разделенных по полу сперматозоидов (1 млн клеток) оплодотворяемость составила 52 %. Эти показатели сопоставимы с результатами обычного искусственного осеменения коров криоконсервированной спермой, содержащей в дозе 15-20 млн половых клеток (33). При внутриматочном осеменении телок разделенной по полу криоконсервированной спермой (1; 1,5 или 3 млн сперматозоидов в дозе) также удалось получить высокие показатели оплодотворяемости (43-54 %) (34).

В полевых испытаниях швейцарских ученых телкам и коровам опытных групп внутриматочно вводили по 2 млн подвижных заморожено-оттаянных сперматозоидов с Х-хромосомой. В контрольных группах животных осеменяли аналогичной дозой не разделенных половых клеток. В опытной и контрольной группах отелилось соответственно 29,6 и 55,6 % телок; 21,9 и 23,4 % коров. При этом в опытных группах родилось 85,3 % самок, в контрольных — 58,6 % (35).

Эстонские исследователи выясняли эффективность осеменения телок разделенной спермой при введении 2,2 млн заморожено-оттаянных сперматозоидов в маточно-трубное сочленение, рога или тело матки (36). Оплодотворяемость телок во всех вариантах оказалась практически одинаковой и составила соответственно 37,7; 42,2 и 39,6 %.

В Финляндии проводились испытания по осеменению коров голштинской породы криоконсервированной разделенной спермой (37). Во время спонтанной охоты 157 опытным коровам вводили внутриматочно 2 млн разделенных сперматозоидов, 149 контрольным коровам — 15 млн не разделенных сперматозоидов. В опытной группе отелилось 20 % коров и родилось 82 % телочек. В контроле эти показатели составили соответственно 45 и 49 %. Полученные результаты свидетельствуют о значительном снижении оплодотворяемости при использовании для осеменения пониженного числа сперматозоидов в дозе разделенной спермы.

В экспериментах итальянских ученых при введении телкам внутриматочно криоконсервированной разделенной спермы, полученной от четырех быков (1 или 2 млн сперматозоидов), оплодотворяемость составила 51 %, в потомстве было 87 % самок. Кроме того, были выявлены достоверные различия в оплодотворяющей способности семени у разных быков. По мнению авторов, необходимо проводить тщательный отбор быков перед их использованием для получения разделенной по полу спермы (38).

В полевых испытаниях, проведенных в США на 211 фермах, оплодотворяемость телок голштинской породы Х-содержащей фракцией сперматозоидов достигала 47 %, телок джерсейской породы — 53 %. В потомстве получено 89 % самок (39). Кроме того, был установлен факт более высокой мертворожденности телят мужского пола при осеменении телок сперматозоидами с Х-хромосомой.

В специальных исследованиях изучали влияние процесса разделения спермы с помощью скоростной проточной цитометрии на состояние здоровья и развитие телят, а также на генетические изменения у потомства (40). Используя данные по 1169 и 793 телятам, полученным соответственно при оплодотворении коров разделенной и обычной спермой, анализировали продолжительность беременности, легкость отела, частоту абортов и мертворождений, живую массу телят при рождении и отъеме, смертность телят в неонатальный и более поздний период, а также различные анатомические аномалии. Достоверных различий в изучаемых показателях между двумя группами животных установлено не было. При использовании не разделенной спермы получили 49,2 % бычков, Х-содержащей фракции сперматозоидов — 87,8 % самок, Y-содержащей фракции — 92,1 % самцов. Разделение спермы не оказывало влияния на раннюю эмбриональную смертность у телок (34).

Применение высокоскоростной проточной цитометрии для разделения сперматозоидов быков не оказывает отрицательного влияния на структурное состояние ДНК в клетках (41). Коммерческое использование разделенной по полу спермы в зарубежных странах началось с 2000 года и к настоящему времени в мире получено более 2 млн телят (42). В основном разделенную сперму быков используют для осеменения телок. В среднем в дозе содержится не менее 2 млн подвижных сперматозоидов. Предпринимаются попытки улучшить биологическую полноценность разделенной спермы в процессе ее криоконсервации. В частности, изучено защитное влияние на половые клетки быков антиоксидантов пирувата натрия и каталазы, добавление которых в состав синтетической среды улучшало подвижность и живучесть заморожено-оттаянных сперматозоидов (43). Совместное введение в состав среды для разделения сперматозоидов бычьего сывороточного альбумина и антиоксидантов значительно повышало живучесть и оплодотворяющую способность не замороженных половых клеток (44).

Основная трудность использования разделенной спермы в свиноводстве состоит в том, что в дозе должно содержаться большее число сперматозоидов по сравнению с дозой для крупного рогатого скота. Первые поросята от разделенного семени были получены после лапароскопического введения спермы непосредственно в яйцеводы свиней (20). Позднее яйцеклетки свиней оплодотворяли in vitro c использованием фракции Х-сперматозоидов (45). Все потомки, родившиеся у свинок после пересадки им таких эмбрионов, оказались самками. В других экспериментах удалось получить потомство мужского пола при внутрицитоплазматическом введении разделенных не замороженных сперматозоидов хряка в яйцеклетки и дальнейшей их активации in vitro (46).

С целью уменьшения числа сперматозоидов в дозе для осеменения свиней разработана методика глубокоматочного введения спермы через цервикальный канал с помощью гибкого катетера (47, 48). Оказалось, что для нормальной оплодотворяемости свиней достаточно ввести в верхушку рога матки 50-70 млн разделенных сперматозоидов (49, 50). Кроме того, предлагается вводить семя непосредственно в яйцеводы с помощью лапароскопа (51, 52). Использование этой методики позволило достичь высокой оплодотворяемости при дозе 0,3; 0,5 и 1 млн сперматозоидов. Анализ генетических изменений в лимфоцитах поросят, полученных от разделенного семени, не выявил мутагенного воздействия высокоскоростной проточной цитометрии на половые клетки (53). При двукратном осеменении свиней разделенной заморожено-оттаянной спермой в дозе 160 млн сперматозоидов отмечено значительное увеличение эмбриональной смертности по сравнению с контрольной группой, осемененной не разделенной спермой (54).

В овцеводстве и коневодстве также проводятся исследования эффективности применения разделенной по полу спермы. Австралийские ученые впервые получили потомство от разделенной спермы баранов в 1996 году (55). Овцам пересаживали эмбрионы, полученные in vitro, с помощью внутриплазматического введения в яйцеклетки одиночных разделенных сперматозоидов. В 1997 году были проведены успешные эксперименты по искусственному осеменению овец разделенной спермой с использованием лапароскопа (56). Эффективность лапароскопического осеменения овец заморожено-оттаянной разделенной спермой была изучена в специальных опытах (57). Овцам опытных групп внутриматочно вводили 1, 5 и 15 млн заморожено-оттаянных разделенных сперматозоидов, контрольным животным — 50 млн не разделенных сперматозоидов. Оплодотворяемость в опыте составила соответственно 61,5; 66,1 и 66,7 %; в контроле — 63,2 %.

При введении разделенной не замороженной спермы в верхушку рога матки кобылам было получено 87 % потомков желаемого пола (58). По мнению ряда ученых, более перспективный способ осеменения кобыл разделенной спермой — гистероскопическое введение семени непосредственно в верхушку рога матки (59, 60). Более высокой оплодотворяемости кобыл от разделенного семени удалось достичь при введении 20 млн сперматозоидов в маточно-трубное сочленение (61). C использованием этой технологии получено потомство и от криоконсервированной разделенной спермы жеребцов (42).

Таким образом, технология разделения сперматозоидов по полу с использованием высокоскоростной проточной цитометрии представляет эффективный способ регуляции пола и в настоящее время находит применение в практике разведения не только крупного рогатого скота, но и других видов сельскохозяйственных животных. Дальнейшее совершенствование этой технологии позволит улучшить результативность разделения сперматозоидов и повысить эффективность искусственного осеменения животных.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. М и л о в а н о в В.К., Е р о х и н А.С. Направления и перспективы искусственного регулирования соотношения полов в потомстве (Обзор). Сельское хозяйство за рубежом, 1980, 1: 43-47.
2. Е р о х и н А.С. Регулирование овуляции и соотношения полов у млекопитающих. Дисс. канд. биол. наук. Дубровицы, 1982. 3. Joerg H., A s a i M., G r a p h o d a t s k a y a D. e.a. Validating bovine sexed semen samples using quantitative PCR. J. Anim. Breed. Genet., 2004, 121: 209-215.
4. G a r n e r D.L., G l e d h i l l B.L., P i n k e l D. e.a. Quantification of the X- and Y-chromosome-bearing sperm of domestic animals by flow cytometry. Biol. Reprod., 1983, 28: 312-321.
5. W e l c h G.R., J o h n s o n L.A. Sex preselection: laboratory validation of the sperm sex ratio of flow sorted X- and Y- sperm by sort reanalysis for DNA. Theriogenology, 1999, 52: 1343-1352.
6. S e i d e l G.E. Jr., G a r n e r D.L. Current status of sexing mammalian spermatozoa. Reproduction, 2002, 124: 733-743. 7. M o r u z z i J.F. Selecting a mammalian species for the separation of X- and Y-chromosome –bearing spermatozoa. J. Reprod. Fertil., 1979, 57: 319-323. 8. J o h n s o n L.A., W e l c h G.R. Sex preselection: high-speed flow cytometric sorting of X- and Y- sperm for maximum efficiency. Theriogenology, 1999, 52: 1323-1341.
9. P i n k e l D., G l e d h i l l B.L., V a n D i l l a M.A. e.a. High resolution DNA measurement of mammalian sperm. Cytometry, 1982, 3: 1-9.
10. J o h n s o n L.A., F l o o k J.P., H a w k H.W. Sex preselection in rabbits: live birth from X- and Y- sperm separated by DNA and cell sorting. Biol. Reprod., 1989, 41: 199-203. 11. J o h n s o n L.A., W e l c h G.R., R e n s W. The Beltswille sperm sexing technology: high-speed sorting gives improved sperm output for IVF and A.I. J. Anim. Sci., 1999, 77, Suppl. 2: 213-220.
12. S e i d e l G.E. Jr. Overview of sexing sperm. Theriogenology, 2007, 68: 443-446.
13. J o h n s o n L.A., F l o ok J.P., L o o k M.V. Flow cytometry of X- and Y- chromosome — bearing sperm for DNA using an improved preparation method and staining with Hoechst 33342. Gamete Research, 1987, 17: 203-212.
14. R e n s W., W e l c h G.P., J o h n s o n L.A. A novel nozzle for more efficient sperm orientation to improve sorting efficiency of X- and Y- chromosome-bearing sperm. Cytometry, 1998, 33: 476-481.
15. S e i d e l Jr. G.E. Sexing mammalian sperm-intertwining of commerce, technology, and biology. Anim. Reprod. Sci., 2003, 79: 145-156.
16. J o h n s o n L.A., F l o o k J.P., L o o k M.V. e.a. Flow sorting of X- and Y-chromosome bearing spermatozoa into two populations. Gamete Research, 1987, 16: 1-9.
17. C r a n D.G. Semen sexing, practice and application. Third conf. of Europ. Society for domestic animal reprod. Anger, France, 1999: 18-19.
18. M a x w e l l W.M., J o h n s o n L.A. Physiology of spermatozoa at high dilution rates: the influence of seminal plasma. Theriogenology, 1999, 52: 1353-1362.
19. K l i n c P., R a t h D. Application of flowcytometrically sexed spermatozoa in different farm animal spicies: a review. Arch. Tierz., Dummerstorf, 2006, 49: 41-54. 20. J o h n s o n L.A. Sex preselection in swine: altered sex ratios in offspring following surgical insemination of flow sorted X- and Y- bearing sperm. Reprod. Domest. Anim., 1991, 26: 309-314.
21. S i e g B., K l i n c P., F r e s e D. e.a. Improvement of sexed bull semen processing for cryopreservation. Reprod. Domest. Anim., 2003, 38: 329-330.
22. W e l c h G.R., W a l d b i e s e r G.C., W a l l R.J. e.a. Flow cytometric sperm sorting and PCR to confirm separation of X- and Y- chromosome-bearing bovine sperm. Anim. Biotechnol., 1997, 6: 131-139.
23. K a w a r a s a k i T., W e l c h G.R., L o n g C.R. e.a. Verification of flow cytometrically sorted X-and Y- bearing porcine spermatozoa and reanalysis of spermatozoa for DNA content using the fluorescence in situ hybridization(FISH) technique. Theriogenology, 1998, 50: 625-635.
24. J o h n s o n L.A., C l a r k e R.N. Flow sorting of X- and Y- chromosome-bearing mammalian sperm: activation and pronuclear development of sorted bull, boar, and ram sperm microinjected into hamster oocytes. Gamete Res., 1988, 21: 335-343.
25. M o r r e l l J.M., K e e l e r K.D., N o a k e s D. e.a. Sexing of sperm by flow cytometry. Vet. Record, 1988, 122: 322-324.
26. C r a n D.G., J o h n s o n L.A., M i l l e r N.G. e.a. Production of bovine calves following separation of X- and Y- chromosome-bearing sperm and in vitro fertilization. Vet. Record, 1993, 132: 40-41.
27. C r a n D.G., J o h n s o n L.A., P o l g e C. Sex preselection in cattle: a field trial. Vet. Record, 1995, 136: 495-496.
28. W i l s o n R.D., W e i g e l K.A., F r i c k e P.M. e.a. In vitro production of Holstein embryos using sex-sorted sperm and oocytes from selected cull cows. J. Dairy Sci., 2005, 88: 776-782.
29. X u J., G u o Z., S u L. e.a. Developmental potential of vitrified Holstein cattle embryos fertilized in vitro with sex-sorted sperm. J. Dairy Sci., 2006, 89: 2510-2518. 30. S e i d e l Jr. G.E., J o h n s o n L.A., A l l e n C.A. e.a. Artificial insemination with X- and Y-bearing bovine sperm. Theriogenology, 1996, 45: 309.
31. S e i d e l Jr. G.E., A l l e n C.H., J o h n s o n L.A. e.a. Uterine horn insemination of heifers with very low numbers of non- frozen and sexed spermatozoa. Theriogenology, 1997, 48: 1255-1264.
32. S e i d e l G.E. Jr., H e r r i c k h o f f L.A., S h h e n k J.L. e.a. Artificial insemination of heifers with cooled unfrozen, sexed semen. Theriogenology, 1998, 49: 365.
33. S c h e n k J.L., S u h T.K., C r a n D.G. e.a. Cryopreservation of flow-sorted bovine spermatozoa. Theriogenology, 1999, 52: 1375-1391.
34. S e i d e l G.E. Jr., S c h e n k J.L., H e r i c k h o f f L.A. e.a. Insemination of heifers with sexed sperm. Theriogenology, 1999, 52: 1407-1420.
35. B o d m e r M., J a n e t t F., D e n D a a s N. e.a. Fertility after low dose insemination of sexed sperm in heifers and cows under field conditions. Reprod. Domest. Anim., 2004, 39: 254.
36. K u r y k i n J., J a a k m a U., J a l a k a s M. e.a. Deposition of sexed semen at different sites in the uterus at a fixed time and pregnancy rates in heifers. Reprod. Domest. Animal, 2006, 41: 312.
37. A n d e r s s e n M., T a p o n e n J., K o m m e r i M. e.a. Pregnancy rates in lactating Holstein-Friesian cows after artificial insemination with sexed sperm. Reprod. Domest. Animals, 2006, 41: 95-97.
38. C e r c h i a r o I., C a s s a n d r o M., Dal Zotto R. e. a. A field study on fertility and purity of sex-sorted cattle sperm. J. Dairy Sci., 2007, 90: 2538-2542.
39. D e J a r n e t t e J.M., N e b e l R.L., M a r s h a l l C.E. Evaluation the successe of sex-sorted semen in US dairy herds from on farm records. Theriogenology, 2009, 71: 49-58.
40. T u b m a n L.M., B r i n k Z., S u h T.K. e.a. Characteristics of calves produced with sperm sexed by flow cytometry/cell sorting. J. Anim. Sci., 2004, 82: 1029-1036.
41. B o e - H a n s e n G.B., M o r r i s I.D., A n n e t t e B. e.a. DNA integrity in sexed bull sperm assessed by neutral Comet assay and sperm chromatin structure assay. Theriogenology, 2005, 63: 1789-1802.
42. R a t h D., J o h n s o n L. Application and commercialization of flow cytometrically sex-sorted semen. Reprod. Domest. Anim., 2008, 43: 338-346.
43. K l i n c P., R a t h D. Reduction of oxidative stress in bovine spermatozoa during flow cytometric sorting. Reprod. Domest. Animal, 2007, 42: 63-67.
44. K l i n c P., F r e s e D., O s m e r s H. e.a. Insemination with sex-sorted fresh bovine spermatozoa processed in the presence of antioxidative substances. Reprod. Domest. Anim., 2007, 42: 58-62.
45. R a t h D., J o h n s o n L.A., W e l c h G.R. In vitro culture of porcine embryos: development to blastocysts after in vitro fertilization (IVF) with flow cytometrically sorted and unsorted semen. Theriogenology, 1993, 39: 293.
46. P r o b s t S., R a t h D. Production of piglets using intracytoplasmic sperm injection (ICSI) with flow cytometrically sorted boar semen and artificially activated oocytes. Theriogenology, 2003, 59: 961-973.
47. R a t h D. Low dose insemination in the sow. A review. Reprod. Domest. Anim., 2002, 37: 1291-1304.
48. M a r t i n e z E.A., V a z q u e z J.M., R o c a J., e.a. Minimum number of spermatozoa required for normal fertility after deep intrauterine insemination in non-sedated sows. Reproduction, 2002, 123: 163-170.
49. V a z q u e z J.M., M a r t i n e z E.A, P a r r i l l a I. e.a. Birth of piglets after deep intrauterine insemination with flow cytometrically sorted boar spermatozoa. Theriogenology, 2003, 59: 1509-1604.
50. G r o s s f e l d R., K l i n c P., S i e g B. e.a. Production of piglets with sexed semen employing a non-surgical insemination technique. Theriogenology, 2005, 63: 2269-2277.
51. V a z q u e z J.M., M a r t i n e z E.A., P a r r i l l a I. e.a. Improving the efficiency of laparoscopic intraoviductal insemination with sex-sorted boar spermatozoa. Reprod. Fertil. Dev., 2006, 18: 283.
52. G a r c i a E.M., V a z g u e s J.M., P a r r i l l a I. e.a. Improving the fertilizing ability of sex sorted boar spermatozoa. Theriogenology, 2007, 68: 771-778.
53. P a r r i l l a I., V a z q u e s J.M., C u e l l o C. e.a. Hoechst 33342 stain and UV laser exposure do not induce genotoxic effect in flow-sorted boar spermatozoa. Reproduction, 2004, 128: 615-621.
54. B a t h g a t e R., G r o s s f e l d R., S u s e t i o D. e.a. Early pregnancy loss in sows after low dose deep uterine artificial insemination with sex-sorted, frozen-thawed sperm. Animal Reprod. Sci., 2008, 104: 440-444.
55. C a t t S.L ., C a t t J.W., G o m e z M.C. e.a. Birth of a male lamb derived from in vitro matured oocyte fertilized by intracytoplasmic injection of a single “male” sperm. Vet. Record , 1996, 139: 494-495.
56. C r a n D.G., M c K e l v e y W.A., K i n g M.E. e.a. Production of lambs by low dose intrauterine insemination with flow cytometrically sorted and unsorted sperm. Theriogenology, 1997, 47: 267.
57. D e G r a a f S.P., E v a n s G., M a x w e l l W.M. e.a. Succesful low dose insemination of flow cytometrically sorted ram spermatozoa in sheep. Reprod. Domest. Animal, 2007, 42: 648-653.
58. B u c h a n a n B.R., S e i d e l G.E. Jr., M c C u e P.M. e.a. Insemination of mares with low numbers of either unsexed or sexed spermatozoa. Theriogenology, 2000, 53: 1333-1344.
59. M o r r i s L.H., H u n t e r R.H., A l l e n W.R. Hysteroscopic insemination of small numbers of spermatozoa at the uterotubal junction of preovulatory mares. J. Reprod. Fertil., 2000, 118: 95-100.
60. M a r i G., R i z z a t o G., I a c o n o E. e.a. First foal born in Italy using flow cytometrically sorted spermatozoa. Reprod. Domest. Animal, 2008, 43, Suppl. 3: 179.
61. L i n d s e y A.C., V a r n e r D.D., S e i d e l G.E. Jr. e.a. Hysteroscopic or rectally guided, deep-uterine insemination of mares with spermatozoa stored 18 h at either 5 °C or 15 °C prior to flow-cytometric sorting. Anim. Reprod. Sci., 2005, 85: 125-130.