Введение

Долговременное сохранение генетического разнообразия животных и растительных ресурсов одна из основных задач нации. Производство животных жизненно важно для человечества и сохранение их генетического разнообразия является способом страхования нашего будущего. За прошлые столетия было создано много местных, национальных и интернациональных пород животных. Многие породы занимают прочные позиции (местные, региональные, национальные и/или интернациональные) благодаря определенным характеристикам, производительности или адаптационным качествам.

В настоящий момент в мире существует тенденция уменьшения количества интернациональных пород животных, что в свою очередь привело к росту количества редких пород и к снижению общего количества всех пород. Как в Европе, так и во всем мире, имеет место генетическая эрозия, потеря или риск потери пород. В результате селекции, смены пород или генетического дрейфа подвергается давлению как межпородное, так и внутрипородное разнообразие. Поэтому необходимо предпринимать усилия по консервации, которые охватили бы как внутри - , так и межпородное разнообразие. Различают in situ (в национальных парках, заповедниках) и ex situ (в зоопарках, криобанках) программы консервации. В общем случае in situ консервация предпочтительнее как механизм сохранения генетических ресурсов. Для того чтобы порода была удачно сохранена, она должна развиваться и приспосабливаться в меняющейся окружающей среде.

Однако ex situ консервация является важным механизмом, чтобы избежать необратимых потерь пород и генов, для воссоздания породы, для страхования наших ресурсов от санитарных катастроф, для поддержания разведения в малых популяциях и для сохранения генетического разнообразия (генов, свойств, пород) в селекционных программах. Ex situ консервация может быть проведена посредством сохранения в живом виде (например, зоопарки) и путем криоконсервации (в жидком азоте). Во многих странах западной Европы уже созданы национальные банки по сохранению биоразнообразия животных. Каждый из них имеет свою инфраструктуру, но при этом интегрирован в состав мирового банка генетических ресурсов под управлением Всемирной организации по продуктам питания и сельскому хозяйству. В Украине только начинает разрабатываться единая программа по сохранению генетических ресурсов животных. В связи с этим возникает необходимость научно обоснованного расчета норм сохранения тех или иных видов животных и типов биологического материала. В данной работе делается попытка такого расчета для различных видов сельскохозяйственной птицы при сохранении биологического материала в криобанке генетических ресурсов.

Отбор доноров для консервации.

Доноры должны отвечать всем санитарным требованиям и иметь морфологические и поведенческие характеристики, облегчающие сбор генетического материала. Различные цели криоконсервации могут потребовать сохранения различных типов генетического разнообразия, которых можно осуществить путем случайной селекции доноров или отбором по определенному критерию.

Сохранение репрезентативного образца породы рассматривается как наиболее общий случай. Для сохранения репрезентативного образца генетической изменчивости породы особи должны подбираться случайным образом. На практике этого можно достичь путем селекции: а) на основе родословной информации, отдаленно связанных животных; б) животных из различных стад и мест обитания, принимая во внимание генетический поток между стадами и зонами. Если невозможно найти всех необходимых животных в популяции, для сохранения желаемой генетической изменчивости нужно получить определенных доноров путем подходящих скрещиваний.

Количество особей – доноров для консервации.

Количество особей, использованных в качестве доноров, влияет на генетическую изменчивость сохраняемого в криобанке материала. Исходя из гетерозиготности как параметра генетической изменчивости, процент гетерозиготности сохраняемой в банке породы равен 1-(1/(2N)), где N – количество особей-доноров. Часто предлагается использование 25 доноров, соответствующее 98% гетерозиготности. Количество доноров также зависит от объема материала, который можно получить от каждого донора, что в свою очередь зависит от видовой принадлежности. Когда необходимо сохранение существующего разнообразия определенной аллели, вероятность того, что данная аллель окажется в криобанке равна 1-(1-р)2N , где р - частота аллели в конкретной популяции, N - количество доноров. Для сохранения определенных генотипов и племенных линий необходимо определенное количество доноров. В малых популяциях может возникнуть необходимость получения определенных самок или самцов путем соответствующих скрещиваний.

Тип материала для консервации.

Основные виды биологических материалов, которые накапливаются в криобанках, имеют различия по объему генетической информации, которой они обладают и эффективности сохранения. У птиц на настоящий момент для целей долговременного хранения путем криоконсервации можно использовать сперму и ранние эмбриональные клетки.

Сперма может быть использована для реконструкции пород через поглотительные скрещивания, но некоторый процент генов останется от материнской родоначальной популяции. Например, для восстановления 95% генома породы необходимы пять генераций улучшения породы путем поглотительного скрещивания.

Использование эмбриональных стволовых или первичных зародышевых клеток, присутствующих в эмбрионе птиц на ранних стадиях развития, предполагает получение химерных особей по линии половых клеток после инъекции заморожено-оттаянной суспензии клеток. Хотя эффективность этих методов еще находится на довольно низком уровне, в некоторых странах, в частности, Канаде, США ранние эмбриональные клетки птиц уже используются для долговременного хранения в криобанках генофонда птиц.

После того как овца Долли была воссоздана из соматических клеток стало ясно, что метод клонирования можно использовать для воссоздания животных. Данный метод был использован для клонирования и некоторых других видов животных: лошадей, коров, свиней. Консервация соматических клеток – очень дешевый и эффективный метод сохранения широкого спектра генетической изменчивости при ограниченном бюджете. Но до сих пор нет налаженного метода позволяющего воссоздание отдельных особей птиц или животных, а также их линий и пород.

Количество материала для консервации.
Рекомендуется дублировать количество материала и сохранить дубликаты в разных местах.

Реконструкция пород.

Случайные демографические факторы, такие как выбраковка стада по санитарным причинам или ликвидация фермы, и негативные демографические тенденции могут сильно уменьшить размер малых популяций и привести к их исчезновению. Сохранение материала, позволяющего реконструкцию породы, является страховкой от риска их потери. Однако следует заметить, что реконструкция породы может иметь некоторые ограничения: а) в связи с большими расходами, связанными с сохранением больших объемов, реконструированные породы должны проходить через “бутылочное горло” минимизированного количества сохраненных генотипов в криобанке, что означает потерю генетической изменчивости и слабые селекционные возможности в течение нескольких генераций; б) материал часто сохраняется, когда порода уже сильно пострадала и ее генетическая изменчивость возможно уже эродирована. В заключение, по количеству сохраняемого материала для реконструкции породы необходимо, прежде всего, иметь в виду следующие аспекты:

Количество доноров. Рекомендуется сохранить материал по крайней мере от 25 доноров. Эти животные станут родоначальниками воссоздаваемой популяции.

Размер популяции. При ресинтезе размер популяции связан с ее потенциалом для роста и развития и с возможностью сведения к минимуму потерь генетической изменчивости в ходе реконструкции. В птицеводстве разработаны различные схемы сохранения коллекционных стад птицы, где поголовье может колебаться в широких пределах: от 80 (40 курочек и 40 петушков) до 500 кур и 20-50 петушков. Чем меньше поголовье, тем более строгий учет схем скрещиваний и контроль за отбором и оценкой потомства требуется. Если учитывать, что при реконструкции породы можно обеспечить самые благоприятные условия и строго соблюдать все необходимые требования на протяжении всего периода восстановления, то за основу можно принять схему, требующую минимальное количество поголовья воссоздаваемой породы, т.е. 40 петухов и 40 кур. Осеменяя кур каждый раз спермой разных петухов можно достичь незначительного коэффициента инбридинга (не более 0,49% в течение 5 лет) [4]. Следует отметить, что важно не число особей в сохраняемой популяции, а ее эффективная численность, которую определяют по формуле: N=4(Nf x Nm)/Nf+Nm,

где N-эффективная численность популяции, Nf – численность самцов, Nm- численность самок.

Реконструируемая популяция в первом поколении будет состоять из 80 особей.

Количество доз спермы, закладываемых на хранение в криобанк генетических ресурсов.

Семя используется для ресинтеза породы путем серии обратных скрещиваний с группой самок другой породы. Количество сохраняемых доз зависит от:

количества оплодотворенных яиц, получаемых после одного искусственного осеменения самок деконсервированной спермой;
количества фертильных самок ожидаемого от каждой матери в течение жизненного цикла. Эта величина зависит от величин яйценоскости породы, оплодотворенности и выводимости яиц, процента выживаемости и селекции от рождения до половозрелого возраста;
процента генома сохраняемой породы, какой мы хотим иметь в ресинтезированной породе, который зависит от количества генераций улучшающих скрещиваний и равен 1-0,5n, где n – количество генераций;
количества самок и самцов, которое мы хотим воссоздать.

Криоконсервация спермы петухов.

Расчет количества доз спермы, закладываемых на хранение в криобанк генетических ресурсов, проведем на основе эффективности, используемой для замораживания спермы петухов технологии, разработанной в Институте птицеводства УААН в 1991 году [5] и модифицированной в 2003 году [1].

Для воспроизводства птицы требуется получить 25 половозрелых курочек. Для этого на выращивание должно быть посажено:

25 курочек х 3 = 75 суточных цыплят.

Для получения 75 цыплят при выводе 60% (после использования криоконсервированной спермы) требуется заложить на инкубацию:

75 цыплят /0,6 = 125 инкубационных яиц.

Выход инкубационных яиц составляет 80%, поэтому необходимо получить от кур:

125 инкубационных яиц / 0,8 = 156 яиц.

Группа из 25 кур снесет за один день при интенсивности яйцекладки 70% : 25 кур х 0,7 = 17,5 яиц в день.

156 яиц будет получено за: 156 яиц / 17,5 яиц в день = 9 дней

Технологии криоконсервирования спермы птиц предусматривают осеменение птицы два раза в неделю и сбор яйца можно начинать через двое суток после первого искусственного осеменения птицы, поэтому всего потребуется 4 осеменения птицы. На 4 осеменения 25 голов кур будет израсходовано:

4 осеменения х 25 доз = 100 доз спермы петухов.

Поглотительное скрещивание птицы необходимо проводить в течение 5 лет, с получением в конце 40 голов курочек и 40 голов петушков. Для этого необходимо хранить в криобанке:

100 доз х 4 года = 400 доз спермы необходимые в первые 4 года для осеменения 25 курочек и 125 спермадоз для осеменения 40 курочек в пятый год.

Всего требуется заморозить 525 спермадоз.

При хранении предполагается двойное резервирование: 525 спермадоз х 2 = 1050 спермадоз.

На хранении в банке генетических ресурсов необходимо иметь 1050 доз спермы петухов от одной породы (популяции).

Криоконсервация спермы самцов водоплавающей птицы (гусаки, селезни). Расчет количества доз спермы, закладываемых на хранение в криобанк генетических ресурсов, проведем на основе эффективности, используемой для замораживания спермы гусаков технологии, разработанной в Институте птицеводства УААН в 1984 году [3] и модифицированной в 2005 году [2].

Технологии криоконсервации спермы селезней на сегодняшний день не существует. Использование методов консервации, которые были разработаны для спермы гусаков позволяют получить оплодотворенность яиц на уровне 50 – 60 %. Яйценоскость уток значительно выше чем у гусей и поэтому мы можем использовать расчетное количество доз для хранения в криобанке спермы гусаков при закладке на хранение спермы селезней.

Для воспроизводства птицы требуется получить 25 половозрелых гусят (утят). Для этого на выращивание должно быть посажено:

25 голов х 2,1 = 52 суточных гусенка (утенка).

Для получения 52 гусят при выводе 70% (после использования криоконсервированной спермы) требуется заложить на инкубацию:

52 гол. / 0,7 = 75 яиц.

Выход инкубационных яиц составляет 90%, поэтому необходимо получить от гусей:

75 яиц / 0,9 = 83 яйца.

Группа из 25 гусынь снесет за одну неделю 50 яиц, 83 яйца будет получено за 11 дней.

Технологии криоконсервирования спермы гусаков предусматривают осеменение птицы два раза в неделю и сбор яйца можно начинать через двое суток после первого искусственного осеменения птицы, поэтому всего потребуется 4 осеменения птицы.

На 4 осеменения 25 гусынь будет израсходовано 100 доз деконсервированной спермы гусаков.

Поглотительное скрещивание птицы необходимо проводить в течение 5 лет, с получением в конце 40 голов гусынь и 40 голов гусаков. Для этого необходимо хранить в криобанке:

100 доз х 4 года = 400 доз спермы

необходимые в первые 4 года для осеменения 25 гусынь и 125 спермадоз для получения 40 гусынь и гусаков в пятый год. Всего требуется заморозить 525 спермадоз. При хранении предполагается двойное резервирование: 525 доз х 2 раза = 1050 спермадоз.

На хранении в банке генетических ресурсов необходимо иметь 1050 спермадоз спермы гусаков или селезней.

Количество эмбриональных клеток (эмбрионов), закладываемых на хранение в криобанк генетических ресурсов.

Также как и в случае спермы, сохранение эмбриональных клеток имеет целью воссоздание 40 самок и 40 самцов от 25 доноров. Количество эмбрионов, от которых будут приготовлены тотальные суспензии клеток для замораживания, зависит от количества репродуктивных животных, каких мы хотим получить, выводимости оперированных яиц, процента химеризма по линии половых клеток, процента выживаемости и селекции от рождения до половозрелого возраста.

При расчете количества эмбриональных клеток, закладываемых на хранение в криобанк, также исходим из необходимости восстановления эффективной численности популяции равной 80 голов (40 самок и 40 самцов).

В настоящий момент экспериментально доказана возможность криоконсервации эмбриональных клеток кур, выделенных на стадии Х (соответствует стадии свежеснесенного яйца) [6,7]. При инъекции заморожено-оттаянных клеток от одной породы в эмбрионы-реципиенты другой породы получены химерные особи по линии половых клеток. Скрещивание между собой таких химер позволяет восстановить в чистом виде сохраняемую породу в первом поколении химерных особей [8,9]. За жизненный цикл от одной курочки, химерной по линии половых клеток, можно получить 120 половозрелых потомков, из которых 5% составляют особи донорского типа:

1120 гол. х 0,05 = 6 голов.

Для воссоздания эффективной численности (80) необходимо использовать:

80 гол. / 6 гол. = 13 курочек-химер по линии половых клеток.

Если учитывать соотношение полов 1:1, то необходимо получить:

13 химер х 2 = 26 химер по линии половых клеток.

Для производства 26 химер по линии половых клеток при эффективности 10 % нужно получить:

26 химер / 0,1 = 260 химерных цыплят.

Для получения 260 химерных цыплят необходимо инъецировать (при выводимости инъецированных яиц 30%):

260 химер / 0,3=866 яиц.

Количество первичных зародышевых клеток, предшественников сперматозоидов и яйцеклеток, в эмбрионе на использованной стадии развития составляет не более 30 - 40 штук. Поэтому, для инъецирования 866 яиц необходимо использовать суспензию клеток, приготовленную не менее чем из 450 эмбрионов.

Учитывая необходимость дублирования сохраняемого материала для обеспечения надежной сохранности породы или популяции птицы, рекомендуется заморозить клетки от 900 эмбрионов.

По другим видам сельскохозяйственной птицы (индейки, перепела, цесарки) еще не разработаны надежные способы сохранения генетического разнообразия путем криоконсервации.

Ветеринарно-санитарные требования к сохранению генофонда

Согласно „Ветеринарного законодательства” и схем применения вакцин родительские стада кур (доноры) необходимо подвергать специфической профилактике против вирусных инфекций с использованием живых и инактивированных биопрепаратов.

В первый месяц жизни цыплят вакцинируют живыми вакцинами против болезни Марека, реовирусной инфекции, ньюкаслской болезни, инфекционного бронхита кур, болезни Гамборо; ремонтный молодняк возрастом 90-120 дней – инактивированными вакцинами против ньюкаслской болезни, инфекционного ларинготрахеита, инфекционного бронхита кур, болезни Гамборо, реовирусной инфекции, гриппа, инфекционной анемии, инфекционного энцефаломиелита с периодическим определением напряженности иммунитета у привитой птицы, а так же проведение диагностических исследований на пуллороз-тиф, сальмонеллез, туберкулез, стрептококкоз, микоплазмоз, нейссериоз; сроки санации помещений и контроль качества дезинфекции.

Родительские стада (доноры) уток иммунизируют живой вакциной против вирусного гепатита, а гусей - живой вакциной против вирусного энтерита согласно наставлению по их применению.

Сперму, которая будет подвергаться криоконсервации и в дальнейшем использоваться для восстановления генофонда редких пород птицы, необходимо подвергать бактериологическому контролю согласно ДСТУ „Сперма петухов, индюков, гусаков” .

Микробиологические показатели спермы птиц

Общее количество непатогенних бактерій в 1 см3 спермы, не больше 1500 Согласно с ГОСТ 20909.2-75

Коли-титр, см3, не меньше 0,01 Согласно с ГОСТ 20909.2-75

Патогенные и условно патогенные бактерии, грибы, вирусы, микоплазмы и другие микроорганизмы не должно быть Согласно с ГОСТ 23745-79

Для контроля загрязненности спермы перед искусственным осеменением ее обрабатывают антибиотиками.

Литература

Артеменко А.Б., Терещенко А.В., Дунаева О.В. Влияние частоты осеменения кур замороженно-оттаянной спермой на оплодотворенность яиц // Птахівництво: Міжвід. темат. наук. зб. (Матеріали IV Української конф. по птахівництву з міжнарод. участю, 15-19 вересня, 2003 р.) . - Харків, 2003. – Вип.53. – С.372-375.
Низькотемпературне консервування сперми гусаків: Метод. рек./ ІП УААН, Авт. Бичко С.В., Артеменко О.Б., Терещенко О.В. - Бірки, 2005. - 24 с.
Сахацкий Н.И., Андреев В.И., Артеменко А.Б. Эффективная технология низкотемпературной консервации спермы гусаков // Механизмы криоповреждения и криозащиты биологических объектов: Тез. докл.Второй Всесоюз. конф. - Харьков, 1984. - С. 249 - 250.
Сахацкий Н.И, Подстрешный А.П. Популяционно-генетические аспекты сохранения генофонда кур. Птицеводство, -1990, вып. 43, стр. 9-13.
Сахацкий Н.И., Терещенко А.В., Артеменко А.Б. Технология замораживания спермы петухов // Птицеводство. М.: ВО"Агропромиздат", 1991, - N 5. - С.10-11.
Терещенко А.В., Артеменко А.Б., Тагиров М.Т., Белецкая А.В., Сахацкий Н.И. Низкотемпературная консервация бластодермальных клеток эмбрионов кур. С.-х. биология. - 1993. - N 6. - C. 53-58.
Тагиров М.Т., Артеменко А.Б., Кальченко Ю.В. Замораживание клеток ранних эмбрионов кур. Проблемы криобиологии, тезисы докладов Всеукраинской научной конференции."Успехи и перспективы развития криобиологии и криомедицины", - 2001, - N 3. - С.56.
Kino K., B. Pain, S. P. Leibo, M. Cochran, M.E. Klark, and Etches, Production of chicken chimeras from injection of frozen-thawed blastodermal cells. -1997 Poultry Science 76: 753-760.
Naito M., A. Tajima, T. Tagami, Y.Yasuda, and T.Kuwana, 1994. Preservation of chick primordialgerm cellsin liquid nitrogen and subsequent production of viable offspring. J. Reprod.Fertil. 102:321-325